O oncologista André Murad (foto), diretor científico do Grupo Brasileiro de Oncologia de Precisão (GBOP) e Diretor Clínico da Personal - Oncologia de Precisão e Personalizada, é primeiro autor de estudo selecionado para apresentação em pôster no AACR Annual Meeting I que avaliou o uso da biópsia líquida com tecnologia de reação em cadeia da polimerase digital em gotas (dd-PCR) para decisão terapêutica em tumores sólidos avançados.

Por André Murad  

A biopsia liquida (BL) por PCR digital em gotas é um novo e promissor método para a análise de pequenas quantidades de ácido nucléico circulante livre de células (cf-DNA e cf-RNA) devido à sua alta sensibilidade, baixo custo e rápida leitura, pois dispensa a análise bioinformática. É altamente sensível pois baseia-se no fracionamento da amostra em milhares de reações individuais nanométricas de água em óleo, o que resulta em uma biopsia líquida de altíssima sensibilidade, detectando mutações somáticas derivadas do tumor a uma taxa de 0,01% em relação ao alelo selvagem. Portanto, uma alternativa apropriada ao sequenciamento de nova geração (NGS) para a detecção de biomarcadores específicos para orientar a terapia alvo-molecular de câncer avançado.

Nosso ensaio cobre as principais alterações pontuais dos genes terapeuticamente acionáveis: EGFR (mutações), ALK (fusão), ROS1(fusão), BRAF (mutações), KRAS (mutações), NRAS (mutações), ERBB2 (número de cópias-CNV), TERT (mutações), PIK3CA (mutações) e ESR1 (mutações). Portanto, nossos genes podem ser utilizados em painéis específicos tanto na genotipagem, com finalidade de escolha terapêutica, quanto na detecção de resposta molecular e também resistência secundária de tumores sólidos como pulmão (células não pequenas - CPCNP), mama, colorretal, melanoma, pâncreas e ovário. Até o momento, 54 pacientes já foram testados. 

Métodos

Os testes foram validados utilizando-se como padrão ouro amostras de tumor em parafina, testados com tecnologia NGS através do painel Oncomine Focus da 

Thermo Fisher em dezembro de 2017. Os testes foram iniciados em janeiro de 2018 e seguem até o momento. 

O ddPCR foi realizado usando o sistema QX200 (BIO-RAD®, Hercules). A extração de DNA e RNA foi feita através da técnica de ‘beads’ magnéticas do Kit MagMAX da Thermofisher. Todas as amostras foram testadas em duplicata. 54 pacientes com câncer metastático portadores de CPCNP (14), mama (11), colorretal (11), melanoma (9), pâncreas (4), ovário (3) e glândulas salivares (2). 

Desafios para sua implementação

1.  Extração de RNA periférico (Laboratório Personal) – Detecção dos Genes de Fusão 

 - Extração de ácido nucleico total (DNA + RNA) e tratamento com DNAse. O 

RNA total então é submetido à RT-PCR para formação do cDNA. O RNA é armazenado a -80;

- Kit para a extração do RNA para a biopsia líquida em dd-PCR é da Thermo Fisher de Beads magnéticas (MagMAX Nucleic Acid Isolation Kits);

2. Tempo de entrega inferior a 4 dias; 

3. Custo final inferior a 600 dólares o painel;

Resultados

Foram detectadas alterações genômicas significativas em 19 (35%) pacientes: 5 (9%) mutações no gene KRAS G12V (todas em câncer colorretal), 5 (9%) 

amplificações de ERBB2 (em câncer de mama), 2 (3,65%) mutações EGFR L858R (CPCNP), 2 (3,5%) mutações EGFR del19 (CPCNP), 2 (3,5%) mutações EGFR T790M (CPCNP), 2 (3,5%) mutações BRAF-V600E (cólon e melanoma), 1 (1,8%) fusão de ALK-EML4 (CPCNP). A fração de alelo mutante (MAF) variou de 0,9% a 24%. Em todos os casos, os resultados foram decisivos para a indicação ou a mudança de uma terapia direcionada. O período médio de entrega dos resultados foi de 36 horas e o custo médio dos painéis foi de aproximadamente 500 dólares, com uma média de 4 genes por painel. 

Em conclusão, os resultados sugerem que a biopsia líquida por ddPCR é um método altamente sensível e pode ser utilizado para detecção laboratorial de rotina das variações genômicas importantes para determinar a terapia-alvo em tumores sólidos avançados. Seu baixo custo e rapidez de execução fazem desta metodologia de biopsia líquida uma alternativa atrativa e viável quando comparada aos painéis de biópsia líquida em NGS, que demandam semanas para a execução, além de custo elevado e necessidade de análise bioinformática.

O estudo contou com a participação dos médicos José Cláudio Casali e Juliana Carneiro.

Referência: Session Category: Clinical Research
Session Title: Circulating Markers 3
Permanent Abstract Number: 3115
Publishing Title: A single institution experience with droplet digital polymerase chain reaction (dd-PCR) liquid biopsy (LB) for therapeutic decision in advanced solid tumors - Andre M Murad MD, PhD, Post-Doc, José C Casali-da-Rocha MD, PhD, Juliana G Carneiro PhD - Personal  Oncologia de Precisão e Personalizada - Clínica de Oncologia de Precisão e Laboratório de Genética Molecular de Precisão. Belo Horizonte, MG. Brasil.