Mutações drivers em câncer de pulmão não pequenas células (CPNPC) têm valor prognóstico e preditivo e são relevantes para o manejo clínico. Estudo de Rodrigo Cavagna (foto) e colegas do Hospital de Câncer de Barretos descreve todas as etapas envolvidas em uma análise genômica de amostras de CPNPC por reação em cadeia da polimerase (PCR), desde o isolamento do DNA a partir do tecido tumoral, até o sequenciamento de regiões de hotspot (EGFR, KRAS e BRAF).
Cavagna et al. esclarecem que o método de PCR seguido por sequenciamento direto de Sanger é um dos mais empregados entre as técnicas para analisar mutações genômicas no adenocarcinoma pulmonar. “Na prática de rotina, as principais etapas para análise mutacional por abordagem de PCR seguida por sequenciamento de Sanger são o isolamento e a quantificação de DNA, neste caso específico a partir de amostras de câncer de pulmão, além da análise do desempenho da PCR e da purificação dos produtos da reação de sequenciamento”, explicam os autores.
Diferentes parâmetros precisam ser cumpridos para garantir a especificidade e eficiência da análise genômica por PCR, como os gradientes de temperatura e ciclos de tempo de cada etapa, as concentrações, pH e o equilíbrio adequado entre os reagentes. Nesta análise, Cavagna et al. discriminam o material necessário para purificar o DNA, incluindo reagentes e kits para extração, PCR e sequenciamento de tecido embebido em parafina e fixado em formalina (PEFF), lembrando que a amostra deve estar previamente corada em hematoxilina / eosina.
Os autores também detalham os parâmetros para amplificação de cada perfil genômico (EGFR, KRAS e BRAF), em análise que presta contribuição aos estudos moleculares em câncer de pulmão.
Aplicações
As mutações nos genes drivers são relevantes para o manejo clínico dos pacientes com câncer de pulmão. As mutações EGFR estão entre as alterações drivers mais importantes no adenocarcinoma pulmonar, com valor preditivo para a seleção de terapias-alvo com inibidores da tirosina-quinase (TKi), embora mutações em KRAS e BRAF também sejam descritas nessa população de pacientes.
Entre as mutações com valor preditivo, os autores lembram que “diferentes mutações EGFR já foram descritas e mostram sensibilização a TKis, especialmente p.Leu858Arg 21 (localizado no exon 21) e deleções no exon 19 (p.Glu746_Ala750-22 del e p.Leu747_Pro753del), enquanto p.Thr790Met (localizado em 23 exon 20) é a mutação mais frequentemente associada à resistência a TKi”, destacam.
Cavagna et al. ilustram ainda o valor de mutações prognósticas no CPNPC. ” As mutações prognósticas mais importantes são as mutações KRAS localizadas nos códons 12 e 13, que estão associadas com pior prognóstico. Embora as mutações KRAS não tenham valor preditivo, esforços significativos têm sido feitos pela comunidade científica para desenvolver terapias-alvo direcionadas contra essas mutações”, apontam.
Os pesquisadores de Barretos relacionam diferentes opções que estão disponíveis para a análise mutacional de amostras de câncer de pulmão, como o ensaio COBAS 66 ®, além de técnicas, como PCR digital e painéis NGS (painel TruSight -Illumina; Cancer Hotspot - Ion Torrent, etc.).
"A reprodutibilidade dos testes moleculares empregados no contexto da medicina de precisão é essencial para garantir a melhor conduta de tratamento para o paciente. O nosso capitulo neste livro permite a reprodutibilidade em qualquer centro, com infraestrutura adequada, de alguns ensaios empregados no contexto da medicina de precisão para câncer de pulmão", destaca Rodrigo Cavagna.
A íntegra do artigo está no novo livro da série Methods in Molecular Biology, da Springer, a primeira série a apresentar protocolos com o passo a passo de abordagens que podem ser amplamente reproduzidas. Testados e confiáveis, todos os protocolos da série são indexados no PubMed.
Referência: de Oliveira Cavagna R., Leal L.F., de Paula F.E., Bernardinelli G.N., Reis R.M. (2021) A PCR-Based Approach for Driver Mutation Analysis of EGFR, KRAS, and BRAF Genes in Lung Cancer Tissue Sections. In: Santiago-Cardona P.G. (eds) Lung Cancer. Methods in Molecular Biology, vol 2279. Humana, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1278-1_9
