Estudo realizado por pesquisadores do Hospital de Amor (Hospital de Câncer de Barretos) comparou seis métodos diferentes de remoção de melanina do DNA genômico. O objetivo é remover a melanina antes de realizar os métodos de PCR, o que impacta diretamente as aplicações de pesquisa e os testes de diagnóstico molecular necessários para terapias-alvo. Publicado no periódico Histology & Histopathology, o trabalho tem como autor sênior o cirurgião oncológico Vinicius de Lima Vazquez (foto).
A melanina é produzida pelos melanócitos e protege contra danos no DNA pela luz ultravioleta. Infelizmente, a proteína melanina presente nas células tumorais do melanoma é frequentemente co-purificada durante a extração do DNA, e essa contaminação pode inibir os métodos de PCR subsequentes e impactar a pesquisa e os testes de diagnóstico molecular necessários para terapias-alvo. Atualmente, não existem protocolos de purificação descritos que removam eficientemente a melanina do DNA genômico.
“Este trabalho surgiu de um problema real. A amplificação de DNA de amostras de melanoma, principalmente de parafina, na presença de grande quantidade de melanina apresenta altos índices de falha. Achar uma solução era crucial, pois o sequenciamento de DNA de melanomas faz parte da prática diária para a escolha terapêutica dos pacientes”, explica Vazquez.
O estudo
Neste estudo, foram comparados seis diferentes métodos de remoção de melanina do DNA genômico: eletroforese em gel de agarose, 1mg de Chelex®-100, Chelex®-100 5%, centrifugação, kit de remoção de inibidor de PCR OneStep™ e centrifugação mais kit de remoção de inibidor de PCR OneStep™. Cada comparação foi feita utilizando 16 amostras de linha celular frescas fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE).
Todas as amostras foram inicialmente testadas usando a reação de PCR multiplex para o gene GAPDH, que gera produtos amplificados de diferentes tamanhos: 100, 200, 300 e 400 pares de bases, que poderiam ser inibidos pela adição de melanina exógena.
Seis protocolos de purificação foram aplicados, e todas as amostras que amplificaram pelo menos um fragmento de GAPDH foram sequenciadas para analisar a presença da mutação BRAFV600E. As eficiências de amplificação diminuíram para fragmentos maiores em todos os métodos.
“Nossas comparações mostraram que a centrifugação combinada com kit de remoção de inibidor de PCR OneStep™ foi superior a todos os outros métodos de sequenciamento BRAF com 100% (100pb), 75% (200pb), 50% (300pb) e 31,3% (400pb) de eficiência de amplificação para os diferentes tamanhos de amplicons”, afirmam os autores.
Os pesquisadores concluíram que o método de extração de DNA genômico é altamente eficiente para uma PCR bem-sucedida quando amostras de tumores estão contaminadas com melanina. “O sucesso desta técnica irá possibilitar um melhor diagnóstico e consequentemente melhor tratamento para pacientes já no presente. Isso para nós é motivo de grande satisfação”, conclui o especialista.
Referência: Comparison of protocols for removal of melanin from genomic DNA to optimize PCR amplification of DNA purified from highly pigmented lesions - Anna Luiza Silva Almeida Vicente, Raquel Alves Bianchini, Ana Carolina Laus, Graziela Macedo, Rui Manuel Reis and Vinicius de Lima Vazquez - DOI: 10.14670/HH-18-112
